slide show November 2002
|
|
slide show November 2002 |
|
Sandro Rusconi, Univ. Fribourg, Svizzera
clicca qui per scaricare il documento powerpoint (1.8 Megabytes!)
La diapositiva ricapitola il curriculum dell'autore. Si fa notare come SR non abbia formazione specifica in medicina, ma una formazione dedicata alla ricerca fondamentale in biologia molecolare, con enfasi nello studio dell'espressione genica.
Questa diapositiva riassume i capitoli che sono trattati in questa esposizione. Si partirà con alcune considerazioni sulla natura dei geni e dei genomi. in seguito si passa a discutere delle applicazioni in medicina (secondo pannello, medicina molecolare), per poi arrivare alla descrizione delle tecnologie essenziali della genomica (terzo pannello). Gli ultimi due capitoli trattano delle applicazioni, dell'impatto e delle conclusioni e sviluppi.
Diapositiva 4: Did I talk about 'future'?
Ci sono molti modi di 'vedere' il futuro, e non tutti sono basati su tecniche verificabili. I profeti hanno una tradizionale caratteristica di enfatizzare molto le loro previsioni azzeccate 'a posteriori'. Peccato che ci siano troppe previsioni e tanto contraddittorie da coprire tutti gli scenari possibili ed impossibili, e che non si sappia mai 'a priori' chi avrà ragione.
Diapositiva 5: Genetics has been used since millennia
Nell'immaginario collettivo la genetica e le sue applicazioni tendono ad essere considerate 'diavolerie di questo secolo'. In effetti, l'applicazione empirica della genetica ha accompagnato tutto il processo di evoluzione sociale dell'umanità.
Da centinaia di migliaia di anni gli esseri umani hanno selezionato e distillato proprietà ereditabili nelle specie animali e vegetali. Da migliaia di anni hanno padroneggiato le tecniche di microbiologia con la fermentazione degli alimenti (pane, formaggio, iogurt, birra, vino).
È solo da una trentina d'anni che gli scienziati sono in grado grazie alla genetica molecolare di comprendere, seguire e persino modificare ed influenzare la funzione delle molecole che sono implicate nel processo di trasmissione ereditaria dei caratteri. Da un paio d'anni possiamo addirittura usufruire della sequenza praticamente integrale del patrimonio genetico dell'essere umano e di altri organismi.
Diapositiva 6: 1 gene -> 1 or more functions
Un gene può venir definito un po' sommariamente come un segmento di DNA che attraverso un processo complesso (conosciuto sotto il nome di 'espressione genica') da origine ad un RNA messaggero (trascrizione) il quale viene poi tradotto in una proteina (traduzione). Nella 'dottrina classica' che molti di noi hanno imparato, un gene corrispondeva ad una funzione: ci avevano insegnato che c'é un gene per l'emoglobina beta, un altro per l'emoglobina alfa, uno per l'insulina, eccetera... L'implicazione era che a) un gene dovesse codificare per un solo prodotto, b) che il gene fosse attivo solo nelle cellule del tessuto corrispondente, c) che una proteina avesse una sola funzione. Sebbene, all'inizio sembrassero reggere perfettamente, nessuna di queste tre affermazioni é risultata formalmente corretta. Lo stesso segmento di DNA può generare mRNA messaggeri molto diversi grazie ad una varietà di possibilità alternative (compreso lo splicing alternativo) e lo stesso RNA messaggero può essere tradotto in proteine diverse, grazie ad una molteplicità di meccanismi di iniziazione e terminazione alternativa). Infine una proteina può venir modificata in modi diversi, assumendo caratteristiche molto differenti. Anche la stessa identica forma di proteina può avere funzioni diverse. Vi sono proteine originariamente classificate come enzimi o come componenti del cito-scheletro che hanno in seguito rivelato proprietà insospettabili come fattori di trascrizione (che nel nucleo cellulare regolano la funzione di geni specifici). In fondo l'ossessione di 'assegnare una funzione' ad un gene riprende un po' la cultura biblica di creazionismo. Se vogliamo essere dei veri cultori della teoria evoluzionista dovremmo astenerci dall'assegnare funzioni 'a priori ed a posteriori' ed accettare che i geni ed i loro prodotti si devono 'auto-giustificare' nel sistema evolutivo. Di conseguenza le funzioni non sono state assegnate in maniera deterministica ma sono state 'scovate' dai geni stessi. Da questo punto di vista diventa impossibile pretendere che un gene racchiuda una sola funzione e che questa sia la stessa in organismi diversi o in tempi evolutivi diversi. Ontogeneticamente, questa varietà di funzioni può essere senz'altro ricapitolata. E non dovrebbe sorprendere più di quel tanto scoprire che lo stesso gene ha funzioni diverse durante lo sviluppo embrionale e nell'adulto. Per questo, il dibattito su 'quanti geni ci sono nel genoma umano' rimane un discorso un po' patetico. In effetti se ne sono identificati circa 45'000 (sommando gli sforzi dei due progetti di genoma umano, le cui annotazioni si sovrappongono solamente parzialmente). Personalmente prevedo che si scopriranno molti geni supplementari e che finalmente la complessità sarà attorno alle centomila unita, che danno una media da 300 mila a 500 mila funzioni prevedibili.
Diapositiva 7: 1 organism more than 100'000 genetically functions
In queste immagini si riassume il concetto di organismo come insieme di organi, composti da tessuti, i quali sono a loro volta composti da cellule differenziate in modo specifico. Tutte queste cellule derivano da una cellula iniziale (l'ovulo fecondato) e portano lo stesso genoma, che però viene manifestato in modi diversi. Alcuni geni sono espressi, altri invece rimangono 'silenti' o latenti. Con la clonazione del nucleo cellulare (il cui esempio primordiale per i vertebrati fu la pecora Dolly nel 1998), si é potuto dimostrare che effettivamente una cellula differenziata, se opportunamente 'riprogrammata' può rigenerare un intero organismo. Il cercare di carpire i meccanismi che stanno a monte di questa regolazione dei geni (gene expression) é uno dei settori di ricerca più affascinanti.
Diapositiva 8: But finally, ...how many genes exactly
Questa diapositiva riprende il discorso della diapositiva 6, e cerca di dimostrare come si può arrivare ad una previsione di centomila geni. In gran parte la nostra difficoltà corrente consiste nel riconoscere 'a priori', cioè a partire dalla sequenza, se un certo segmento di DNA corrisponde ad un gene. Questo é un lavoro ancora estremamente aleatorio perché si basa sulle conoscenze limitate che abbiamo sulle sequenze che sono capaci di segnalare al complesso macchinario enzimatico del nucleo 'dove inizia' dove termina' e 'quando' e 'quanto' un gene deve essere espresso (vedi 'gene expression) diapositiva 7).
Diapositiva 9: what is in fact a gene?
In questa animazione cerco di descrivere brevemente gli elementi che entrano in gioco nel concetto di 'gene'. Come già ampiamente commentato un gene fornisce la sequenza necessaria per determinare un tipo di proteina (con tutte le varianti possibili spiegate nella diapositiva 6).
sequenze di 'spacer' (in arancio). I geni sono distribuiti in diverse posizioni nel 'genoma' e sono separati da sequenze che si riassumono nel concetto di 'spacer'. La funzione di tali sequenze non è ancora pienamente apprezzata. C'é chi le chiama sommariamente 'junk DNA' (DNA spazzatura) per la semplice ragione che si possono alterare anche in modo drastico senza poter osservare conseguenze particolari (queste sequenze sono poco conservate tra organismi evolutivamente distinti). Infatti ci sia accorge dell'importanza di tali sequenze 'spacer' quando si introduce un gene in una posizione 'a caso' nel genoma (esempio quando si producono organismi transgenici). In molti casi questo nuovo gene non viene regolato secondo le sequenze che porta con se, bensì in modo imprevedibile, probabilmente dovuto alle sequenze adiacenti.
Sequenze di regolazione' (in rosso). Questi tratti di DNA che possono trovarsi i immediata vicinanza o anche ad una rispettabile distanza dalla parte codificante rappresentano u codice che viene direttamente riconosciuto dai fattori di trascrizione (proteine che sanno 'leggere' e legarsi in maniera reversibile a brevi sequenze di DNA) i quali iniziano una valanga di reazioni che implica varie altre proteine che finiscono per attirare il macchinario di trascrizione (contenente la RNA polimerasi).
Sequenze di codificazione (in celeste) Questo macchinario viene indirizzato alla posizione di inizio e spinto a ricopiare in forma di RNA il segmento di DNA codificante (in celeste). Vi sono naturalmente sequenze che determinano la terminazione di tale procedimento, sempre attraverso l'interazione con fattori specifici. l'RNA messaggero che viene prodotto, viene processato in vari modi, trasportato fuori dal nucleo e finalmente riconosciuto da un altro macchinario estremamente complesso che procede alla decodificazione delle proteine a partire dalla sequenza dell'RNA. Come detto in precedenza, il fatto che vi sono molte alternative nel processo di maturazione del l'RNA messaggero e nella sua interpretazione, fa sì che da un segmento modificante si possano ottenere molte proteine distinte, comunque sempre specificatamente dettate dalla sequenza originale.
Diapositiva 10: reductionistic molecular biology paradigm
Il biologo molecolare vede quindi il flusso di informazione dal genoma verso le proteine. In fondo vede un gene come rappresentante di una o più funzioni. Se questo gene si trova in condizioni intatte, allora le funzioni corrispondenti saranno espresse al momento 'giusto', nel tessuto predestinato e nella quantità corrispondente alla necessità dell'organismo. se invece il gene o la sua regolazione sono alterati o assenti, le funzioni corrispondenti saranno alterate o assenti. Infine, se trasferiamo un gene in una cellula e riusciamo a farlo in modo che questo venga espresso, avremo trasferito la o le funzioni corrispondenti. Se questo trasferimento viene eseguito in cellule che contribuiscono alla riproduzione (le cosiddette cellule germinali) allora questa modificazione permanente e trasmissibile darà origine ad un organismo transgenico.
Diapositiva 11: gene amplification / manipulation techniques
Le tecniche che oggigiorno permettono di isolare, amplificare e ricombinare o ridisegnare a piacimento segmenti di DNA (cosiddetta ingegneria genetica) sono di facile accesso e non necessitano di grandi e costosi equipaggiamenti. Queste tecniche hanno permesso i primi passi della genomica e ci hanno progressivamente portato al sequenziamento dell'intero genoma.
Diapositiva 12: the three missions of medicine: impact of molecular techniques
prima di inoltrarci nelle tecniche di genomica, apriamo una breve parentesi sulla medicina molecolare (questa e le prossime tre diapositive).
La medicina ha fondamentalmente tre missioni. troviamo dapprima la prevenzione (primo pannello), che si basa sulla conoscenza degli agenti scatenanti e dovrebbe permettere di evitare in modo attivo o passivo l'insorgenza di patologie con l'aiuto di diete, pratiche di igiene e/o vaccinazione. In seconda linea (non in senso di importanza) troviamo la diagnosi. Senza diagnosi precisa non ci può essere un trattamento specifico. In terza linea troviamo la terapia vera e propria. Le conoscenze di biologia molecolare applicate al campo medico (nella cosiddetta medicina molecolare) hanno avuto un influsso positivo su tutti i tre compiti fondamentali.
Diapositiva 13: the four eras of molecular medicine
La medicina molecolare non ha iniziato subito a pieno ritmo. Una prima fase é stata quella che definisco l'era dei 'geni come sonde'. Questa parte dagli anni ottanta in cui si é iniziato ad utilizzare le conoscenze su alcuni geni i cui difetti sono responsabili di gravi malattie ereditarie (distrofia muscolare, difetti del metabolismo, mucoviscidosi eccetera) per diagnosticarne la possibile insorgenza prima della nascita. Queste tecniche si sono poi ulteriormente estese ad altri settori diagnostici come vedremo in seguito. A partire dagli anni novanta (inizio dell'era dei 'geni come fabbriche') sono arrivati sul mercato i primi biofarmaci, prodotti dalle tecniche biotecnologiche. Questi vengono prodotti mediante il trasferimento di geni umani opportunamente 'ridisegnati' in micro-organismi allo scopo di produrre le proteine corrispondenti (eritropoietina, interferoni, insulina, vaccini eccetera) . All'alba del nuovo secolo (diciamo a partire dal 2000) si affaccia la possibilità di utilizzare direttamente i geni come agenti farmacologici, a mezzo della terapia genica. (per un'introduzione alla terapia genica, vedasi slide show al sito: www.unifr.ch/nfp37/slides/genetherapy2003.ecpm.html ). Questo procedimento che caratterizza l'era che chiamo dei 'geni come farmaci', é ancora altamente sperimentale ma promette interventi mirati in moltissime patologie. diciamo 'promette' appunto perché per ora vi sono solo pochi esempi pratici di successo terapeutico sperimentale con la terapia genica. L'era post-genomica é iniziata ufficialmente dopo la pubblicazione della mappa genomica umana (anche se le sue radici sono anteriori). Le conoscenze portate dalla genomica strutturale e funzionale (due termini che saranno trattati in seguito) promettono di affinare ulteriormente i potenziali rivelati nelle ere e tecnologie precedenti.
Diapositiva 14: the major disease of the 21st century: Ageing!
Quando parliamo di patologie 'moderne' o caratteristiche della nostra epoca pensiamo spesso ai tumori. In fondo questo é solo parzialmente vero, perché la malattia principale dell'umanità industrializzata é un'altra, che é generale ed inevitabile: l'invecchiamento. La speranza di vita alla nascita (primo pannello) all'inizio del 20mo secolo era di 45 anni, questo indice é aumentato a oltre 80 anni in pochi decenni. Ciò implica che malattie che non erano necessariamente preoccupanti a livello di salute pubblica (esempio tumori, pannello 2 o Alzheimer, pannello 3) sono diventate molto frequenti. Le loro curve di incidenza sono inesorabili, e le predisposizioni genetiche positive o negative possono solo spostare la curva media (linea bianca) verso destra o sinistra( curve verdi o rosse), ma non alterarne la forma. Possiamo affermare quindi che se vivessimo sufficientemente, tutti noi dovremmo presto o tardi soccombere a tali patologie. Eccola vera sfida del nostro secolo. tenere sotto controllo le malattie la cui incidenza aumenta in maniera esponenziale dopo i 40 anni di vita. Questo non sarà un compito facile, perché si conosce ancora troppo poco sulle cause e concause (genetiche, comportamentali ed ambientali) di queste malattie. Quindi non sarà facile escogitare trattamenti veramente efficaci. Non si tratta necessariamente di prolungare la durata della vita ma di garantirne la qualità per una durata più lunga possibile.
Diapositiva 15: not only the genome determines the health status...
Come già anticipato nella diapositiva precedente, nessuna patologia ha cause puramente genetiche. C'é sempre una causa o concausa dipendente dall'attività dell'individuo (comportamenti come dieta, assunzione di sostanze più o meno tossiche, attività fisica eccetera) ed una serie di fattori legati all'ambiente (situazione dell'individuo, come esposizione involontaria a radiazioni, sostanze tossiche eccetera) Ho cercato di illustrare questi rapporti di importanza relativa per alcune patologie. Se parliamo di distrofia muscolare, l'impatto della configurazione genica sarà il fattore più determinante mentre comportamento ed ambiente non potranno influenzare più di quel tanto la manifestazione ed il decorso della malattia. Se invece parliamo di cancro ai polmoni, risulta chiaro che nonostante vi possa essere una forte predisposizione genetica, il comportamento e l'ambiente circostante, possono diventare fattori assolutamente decisivi.
Con questa diapositiva si chiude la breve parentesi sulle implicazioni della genetica molecolare per la medicina. Altri esempi specifici verranno trattati in seguito.
Diapositiva 16: genomics: the importance of population homogeneity for functional-locus detection
Se uno scopo della genomica dovesse appunto essere quello di cercare geni che predispongono lo stato di salute (suscettibilità e resistenza agli stimoli patogeni o degenerativi) dell'individuo in maniera più o meno importante, allora occorre diminuire la variabilità dei fattori (vedi diapositiva 15) che potrebbero confondere questa analisi. per questa ragione, alcune società che si occupano di esplorazione genomica (genomic mining) si sono interessate in modo particolare a popolazioni che hanno un 'pedigree' abbastanza omogeneo ed inalterato da secoli, oltre che ad uno stile di vita abbastanza omogeneo e coerente. L'esempio classico é la popolazione islandese che ha anche l'indiscutibile vantaggio di essere stata 'schedata' anagraficamente e dal punto di vista medico in maniera meticolosa da almeno trecento anni. Le aziende di esplorazione genomica hanno già potuto apparentemente individuare alcune dozzine di geni che dovrebbero essere implicati appunto nella protezione o suscettibilità alle degenerazioni tipiche della vecchiaia (ageing control genes). Ora si tratterà di verificare queste correlazioni in maniera sperimentale. Se i risultati saranno altrettanto interessanti come le correlazioni, ci si potrà attendere una serie di diagnosi e anche di trattamenti indirizzati ad accertare e controllare il processo di invecchiamento (vedi diapositiva 14)..
Diapositiva 17: the gen(OME) (the ensemble of genes) and other characters of the 'omics' saga
Dopo tutte queste considerazioni sulla genetica e la medicina, è tempo di inoltrarci nella tecnologia genomica vera e propria. Il suffisso 'oma' indica un 'insieme'. Quindi il genoma é l'insieme dei geni, e la genomica si occupa appunto di studiare un insieme di geni (contrariamente alla genetica molecolare classica che in generale si occupava di un gene alla volta). Si distinguono due livelli di genomica: la genomica STRUTTURALE e la genomica FUNZIONALE. nell'euforia dell'omica, si sono coniati oltre alla PROTEOMICA molti altri epiteti come la FUNCTOMICA, MORFOMICA, GLICOMICA, LIPIDOMICA, ... insomma una serie che sta arrischiando di diventare un po' ..comica
Diapositiva 18: Genomics milestones
Questa diapositiva riprende un video-clip interattivo pubblicato dal consorzio genoma umano, nel quale si riepilogano i momenti salienti delle scoperte più rilevanti in genetica. Si parte da Mendel per arrivare alla sequenza del genoma. Ciò che dovrebbe far riflettere é la densità degli avvenimenti-chiave: uno ogni decennio o ventennio prima degli anni ottanta, poi un'esplosione per superare un avvenimento miliare all'anno a partire dagli anni novanta.
Diapositiva 19: Part 1: structural genomics
La genomica strutturale si occupa di deternminare la sequenza globale dei genomi di vari organismi (vertebrati, batteri, vegetali, virus eccetera), di identificarne le regioni corrispondenti a geni conosciuti o putativi e di stabilire le relazioni evolutive tra le sequenze sia all'interno del genoma stesso (esempio paragonando geni appartenenti alla stessa famiglia) oppure tra genomi di individui diversi (differenze individuali e polimorfismi) oppure tra genomi di specie diverse (cercando di definire le affinità e le differenze che si sono cristallizzate nel corso dell'evoluzione).
Diapositiva 20: Structural genomics aims and techniques
La tecnica principale della genomica strutturale sta nella determinazione della sequenza su larga scala. Per effettuare tali progetti occorrono apparecchi che permettono l'automazione del procedimento di sequenza. I punti cruciali di tale attività sono: (a) la precisione (importante nella rivelazione di sequenze nuove); (b) la velocità di sequenziamento (indispensabile quando si devono ri-sequenziare per migliaia di volte i geni per determinare le variazioni individuali), (c) l'annotazione delle sequenze (l'accompagnamento della sequenza da commenti sulla funzione certificata o ipotetica); d) l'archiviazione elettronica e la sua accessibilità/maneggiabilità (banche dati, algoritmi che permettono il paragone di sequenze, l'allineamento, l'identificazione di motivi conosciuti). Nonostante si siano fatti grandi progressi ai punti (a) e (b); i punti (c) e (d) sono al momento quelli che necessitano ancora di grandi miglioramenti.
Non dimentichiamo che le istituzioni che si occupano di structural genomics, sono anche responsabili del mantenimento ordinato ed accessibile dei frammenti di genoma corrispondenti alle sequenze. Questi frammenti sono mantenuti in collezioni di DNA ricombinanti (cosiddette biblioteche genomiche) e vengono messi a disposizione dei ricercatori che ne fanno richiesta.
Nella fascia di structural genomics possiamo mettere anche il sequenziamento di banche di geni trascritti (i cosiddetti cDNA, che sono la copia di RNA messaggero e quindi corrispondono alla parte 'espressa' del genoma. Con questa attività siamo a cavallo tra structural e functional genomics.
Diapositiva 21: Structural genomics : current impact on research
La grande quantità di dati a disposizione permette di orientarsi rapidamente nella mappa genomica. Praticamente tutte le sequenze sono conosciute. Quindi i ricercatori in biologia molecolare non devono più preoccuparsi di riscoprire tali sequenze. Da cacciatori di geni si sono trasformati in cacciatori di funzioni. Questo é un cambiamento paradigmatico del modo di procedere nella ricerca. L'accesso alle sequenze umane e non umane permette di formulare o scartare ipotesi sull'evoluzione e sulla funzione specifica dei geni ai quali ci si interessa. Fino a cinque anni fa, ciò che oggi si può stabilire con pochi clic di mouse significava mesi e mesi di lavoro e di risorse investite. Quindi é indubbio che la genomica abbia conferito un'accelerazione formidabile alla ricerca sperimentale. I lati negativi di questa rivoluzione sono momentaneamente dovuti a quattro elementi: i) le sequenze identificate ed annotate dal progetto privato (Celera) sono solo parzialmente pubbliche, e per i dettagli occorre sborsare cifre abbastanza rilevanti. ii) le nostre cognizioni sperimentali sono nettamente insufficienti per formulare algoritmi che possano prevedere con certezza l'esistenza di un gene funzionante all'interno di una sequenza. ii) Le sequenze attuali e le loro annotazioni sono ancora molto incomplete e contengono anche alcuni errori rilevanti. iv) molti gruppi di ricerca fanno affidamento su queste sequenze ed annotazioni senza conoscerne i limiti.
Diapositiva 22: Structural genomics : current impact on clinics
A livello clinico la genomica strutturale comincia a produrre dati concernenti la predisposizione genetica a determinate malattie come tumori o disturbi neuro-degenerativi. Queste conoscenze potrebbero rivelarsi presto preziose nella diagnosi differenziale e nella diagnosi pre-sintomatica (discussa nella diapositiva 25). Siamo però ancora solo agli albori di questa disciplina e ci si attende uno sviluppo esponenziale delle conoscenze nei prossimi cinque-dieci anni. Per i lati negativi dobbiamo ammettere che il nostro eccessivo determinismo ci induce a volte a semplificare le ipotesi al punto di renderle poco efficaci perché si scontrano con una maggioranza di 'eccezioni' ed una minoranza di 'regole'. Quando cominceremo davvero a considerare il genoma come elemento globale ci accorgeremo che molte di queste ipotesi dovranno essere rivedute.
Diapositiva 23: Molecular diagnostics: three levels
Nella diapositiva precedente si é parlato di diagnosi molecolare. Quando si fa riferimento all'analisi dei geni a scopo diagnostico, ci si immagina sempre e quasi esclusivamente la diagnosi pre-natale di malattie più o meno gravi. In effetti vi sono due altri livelli di diagnosi: i) la diagnosi pre-sintomatica (che dovrebbe individuare le predisposizioni positive o negative a determinate patologie) e la ii) diagnosi in tempo reale (che si occupa di seguire il decorso della malattia le tecniche di genetica molecolare).
Diapositiva 24: Molecular diagnosis I: prenatal
La diagnosi pre-natale non ha bisogno di grandi presentazioni. Risulta abbastanza evidente che potendo visualizzare i difetti genici che sono alla base di malattie gravi o incurabili (come la mucoviscidosi, la distrofia muscolare eccetera) si può anche procedere ad una selezione pre-natale nelle famiglie a rischio. Per questo tipo di analisi non occorrerebbe far capo alla genomica in senso stretto. Ciononostante, i progressi paralleli alla genomica (esempio il sequenziamento rapido e poco costoso, oppure la rapida determinazione dei polimorfismi) potrebbero permettere di estendere questo tipo di analisi. Cioè si potrebbe immaginare di effettuare analisi in massa, anche nei casi in cui non c'é anamnesi famigliare. Questo permetterebbe di identificare appunto anche i casi di malattie genetiche che non sono direttamente ereditate ma che insorgono a partire da mutazioni spontanee (cosiddetti casi sporadici). Per talune malattie la frequenza di casi sporadici é abbastanza alta (esempio la distrofia muscolare).
Diapositiva 25: Molecular diagnosis II: pre-symptomatic
La diagnostica pre-sintomatica si preoccupa in effetti di dare una prognosi piuttosto che una diagnosi. Si tratta di correlare le variabilità di alcuni geni con una determinata suscettibilità ad una malattia (tumori, malattie autoimmuni, malattie infettive, disturbi cardio vascolari eccetera). Per ora solo poche correlazioni frammentarie esistono ed alcune sono già utilizzate nella pratica, nonostante le conoscenze siano ancora molto primitive (esempio le mutazioni del gene BRCA con il rischio aumentato di tumore al seno). Ci si deve attendere tutta una serie di applicazioni simili, che se ben utilizzate potrebbero rivelarsi estremamente utili. Infatti molte patologie si possono controllare meglio anche con tecniche tradizionali, purché possano venir accertate allo stadio precoce. Se una persona risulta essere predisposta ad una determinata patologia, potrebbe sottomettersi a controlli più regolari e quindi potrebbe essere trattata in modo precoce e mirato, ed in definitiva con maggior successo e minori effetti secondari.
C'é però dietro a queste tecnologie di visualizzazione della predisposizione tutta una problematica ancora irrisolta di gestione Infatti dovrebbero essere accompagnate da competenza assoluta nel comunicare i risultati di tali analisi (a chi, quando e come). Inoltre, occorrerà accompagnare queste pratiche da leggi e regolamenti che garantiscano la protezione della sfera privata dell'individuo per esempio nei confronti del datore di lavoro o nei confronti delle compagnie d'assicurazione.
Diapositiva 26: Molecular diagnosis III: real time
Una diagnosi molecolare può anche venir effettuata durante il decorso della malattia. Ad esempio grazie a sonde molecolari si può identificare la presenza di agenti patogeni in prelievi, oppure si può seguire l'evoluzione di determinati tumori che si trascinano caratteristiche mutazioni del genoma. Queste tecniche possono venir eseguite in poco tempo, e si prevede che tra pochi anni alcune di queste analisi possano venir eseguite direttamente dal medico grazie ad apparecchi di formato portatile. Questa tecnologia é una figlia della genomica, perché tali apparecchi possono venir disegnati grazie ai progressi che sono stati necessari per velocizzare e miniaturizzare il sequenziamento dei genomi. Quindi si tratta di una tecnologia 'spin off' della genomica.
Diapositiva 27: Structural genomics mid-/long-term impact
La genomica strutturale porterà a medio termine ad un accumulo di tecniche che permetteranno una diagnosi differenziata di tumori, all'analisi completa dei genomi di tutti i micro-organismi patogeni principali, ed appunto ad una possibilità di analizzare con rapidità e precisione da parte dello stesso medico curante con dei 'pocket analysers'. A lungo termine ci si attende che il paragone dei genomi dei micro-organismi patogeni ci sveli altri punti deboli che potremo attaccare con antibiotici di quarta generazione. Inoltre ci si aspetta di poter comprendere sempre meglio le conseguenze delle minuscole variazioni individuali e del loro impatto sulla salute, sulla reazione ai farmaci e sulla suscettibilità a disturbi di carattere poli-genico.
Diapositiva 28: Part 2: Functional genomics
Con questa diapositiva entriamo nel campo della genomica funzionale. Si tratta di capire non la struttura (cioè la sequenza) bensì la funzione dei geni. Rispondere cioè alle domande: quando, in che tessuto, in che quantità e sotto quali stimoli vengono espressi quali geni. Se fino a pochi anni fa ci si accontentava di porre queste domande per un solo gene, ora si cerca di capire la 'rete' dei geni che correlano con un certo fenomeno. Per ottenere questi risultati occorre analizzare in simultanea moltissimi geni. Quindi si faranno collezioni di cDNA (vedi diapositiva 20) a partire da tessuti diversi. Molti saranno gli stessi, ma molti altri saranno unici per un determinato tessuto o un determinato periodo dello sviluppo embrionale. Sono appunto i geni 'differenziali' che ci danno il quadro delle identità dei tessuti e delle risposte del genoma a stimoli esterni. Oltre alle sequenze dei messaggeri espressi, se ne analizzano le quantità presenti in varie situazioni (trascrittomica, determinazione dei differenziali di espressione). Infine si possono analizzare in parallelo anche tutte le proteine espresse in una determinata situazione (proteomica). Un'appendice essenziale a tutte queste misurazioni, é la validazione sperimentale delle ipotesi, che si traduce nella generazione di mutazioni mirate volte a determinare il ruolo di un gene nel contesto dell'organismo. Questa tecnica di KO genetico sta producendo una quantità impressionante di modelli animali (topi transgenici KO) di patologie umane. I frutti di queste sperimentazioni (in termini di miglioramenti delle terapie convenzionali e non) potranno essere apprezzati solo fra alcuni anni, forse decenni.
Diapositiva 29: Conventional, 'brute force' genomics
L'analisi globale dei geni espressi a condizioni diverse parte tradizionalmente con un sistema suddiviso in due parti (ad esempio due colture cellulari parallele, in cui una é sottoposta ad uno stimolo e l'altra non subisce alterazioni e serve come controllo negativo). Dopo un certo tempo di incubazione l'RNA messaggero presente viene estratto ed analizzato. Questo conterrà trascritti che hanno identica concentrazione nel controllo e nel campione alterato ed altri che avranno quantità differenti (sia sovra-rappresentati che sotto rappresentati, rispetto al controllo). Queste differenze di concentrazione vengono rilevate in vari modi che non potremo spiegare qui in dettaglio (differential mRNA display, SAGE, differential hybridisation eccetera). Nella prossima diapositiva presenteremo una di queste tecniche. Le differenze vengono annotate e queste rappresentano la 'rete' di risposte genomiche allo stimolo in questione. Si é notato che alcuni stimoli anche semplici (ad esempio l'aggiunta di un singolo ormone) producono differenziali in alcune centinaia di geni. L'analisi di questi 'movimenti globali' di espressione é estremamente complessa sia dal punto di vista statistico che dal punto dio vista quantitativo, e spesso i ricercatori si accontentano di individuare alcuni geni che reputano 'interessanti' (a seconda delle ipotesi perseguite) e ne analizzano poi il comportamento in dettaglio.
Diapositiva 30: molecular diagnosis: microarrays
Uno dei metodi preferiti per misurare simultaneamente il livello di espressione di migliaia di geni é quello dei cosiddetti microarrays. La miniaturizzazione del processo permette di verificare i livelli di decine di migliaia di RNA messaggeri utilizzando pochi milligrammi di tessuto.
Diapositiva 31: Principle of microarrays
La tecnologia dei 'microarrays' (transcriptomics='trascrittomica') si basa su una proprietà elementare del DNA che é quella di ri-formare doppie catene secondo una regola di complementarità molto precisa (nel processo chiamato 'ibridizzazione'). Nei 'gene chips' o 'DNA microarrays' si sfrutta questa capacità di riassociazione specifica per misurare simultaneamente la frequenza relativa di molti RNA messaggeri in un estratto di tessuto.
Una serie di sonde viene depositata sottoforma di minuscole macchioline individuali allineate in modo preciso e determinato (da 500 a 30'000 punti per cm2) su una superficie di vetro o silicio. In ogni macchiolina ci sono milioni di molecole dello stesso mono-filamento di DNA che può associarsi ad una sequenza complementare.
L'RNA messaggero estratto dal tessuto di test viene ricopiato in forma di DNA marcato mediante associazione con molecole che danno fluorescenza rossa. L'analogo procedimento (però con marcatore fluorescente verde) viene effettuato con un RNA estratto da un tessuto di controllo.
I due campioni marcati vengono mescolati in rapporto 1:1 ed utilizzati per l'ibridizzazione con il micro-array. Ognuna delle molecole marcate si associerà solamente nella zona corrispondente alla sonda complementare (se esistente), e colorerà quindi una sola macchiolina.
La fluorescenza viene misurata con un apparecchio speciale. Se i due campioni contengono la stessa quantità di un certo messaggero, si avrà sulla macchiolina corrispondente alla sonda per questo messaggero l'associazione equivalente di molecole 'rosse' e 'verdi' il segnale prodotto sarà 'giallo'. Se invece in uno dei due campioni un certo messaggero é più rappresentato, allora prevarrà nella macchiolina corrispondente la colorazione rossa o verde (a seconda delle proporzioni tra i due campioni).
Quindi con questa tecnica si possono visualizzare rapidamente centinaia o migliaia di identità e differenze a livello di RNA presente in due campioni distinti. Il gran lavoro che rimane da fare naturalmente é di capire come mai questi differenziali vengano a formarsi. E appunto questa é la grande attività generata da queste analisi.
Comunque, già anche senza avere una spiegazione specifica, questi differenziali (se effettivamente riproducibili) diventano una specie di carta d'identità di un certo tessuto o di un certo processo (stimolazione ormonale, tipo di tumore, grado di tumore, tipo di patologia, stadio di sviluppo eccetera). Quindi questi 'patterns' (= schemi) di risposta genica possono diventare preziosissimi e precisissimi strumenti diagnostici o prognostici, anche ben prima di conoscere esattamente il come ed il perché di queste alterazioni di attività.
Diapositiva 32: Principle of 'proteomics'
la quantità di un RNA messaggero non é sempre rappresentativa della quantità di proteina corrispondente, poiché molti processi di regolazione si possono innestare a valle (ad esempio il tempo di degradazione di una certa proteina può venir variato). Inoltre le proteine subiscono ulteriori modifiche che ne alterano le capacità. per questo il secondo livello di genomica funzionale si occupa di esaminare in parallelo ed in modo quantitativo migliaia e migliaia di proteine. Il sistema é analogo a quello dei microarrays: le proteine estratte vengono separate in un sistema bi-dimensionale che genera 'macchioline' che rappresentano una proteina. L'intensità della macchia viene misurata, e la proteina viene identificata a seconda della sua posizione nella separazione oppure viene direttamente micro-sequenziata. I risultati di questa 'proteomica' sono complementari a quelli della 'trascrittomica' discussa nella diapositiva precedente. Il vantaggio é che questi segnali rappresentano effettivamente il 'prodotto finito', mentre la trascrittomica vi da l'immagine di un 'prodotto intermedio'. Lo svantaggio della proteomica é la difficoltà intrinseca nel misurare quantitativamente l'intensità dei segnali ed il fatto di non potersi avvalere delle semplici regole chimiche dell'ibridizzazione per poter identificare il prodotto.
Diapositiva 33: Functional genomics milestones
In questa diapositiva si riassumono le pietre miliari che hanno condotto alla genomica funzionale. In questa conferenza non ci rimane molto tempo per poter commentare anche i progressi nel terzo livello di genomica funzionale (esame degli effetti derivanti da mutazioni genetiche mirate in organismi). Solamente dopo aver verificato le funzioni in organismi transgenici potremo dire di aver veramente compreso gli intricati collegamenti tra geni che sembrano unità isolate.
Diapositiva 34: Functional genomics: current impact on research
La genomica funzionale ha dato grandissimo impulso alla ricerca. L'accessibilità delle tecniche (ora meno onerose ed accessibili anche per gruppi di ricerca con risorse più limitate) ne ha determinato il successo. Non c'é istituto di ricerca che non abbia uno o più gruppi implicati in questo tipo di analisi.
Se dovessimo confessare qualche punto negativo, al momento bisognerebbe far rilevare che molti ricercatori si avvicinano a tale tecnologia senza avere la capacità d'introspezione e la conoscenza sufficienti ad valorizzarne i risultati. Quindi al momento si ha l'impressione di una corsa all'oro un po' confusa (e forse lo é per davvero).
Diapositiva 35: Functional genomics: current impact on clinics
A livello di clinica la genomica funzionale ha cominciato a mostrare il suo potenziale nella diagnosi e prognosi dei tumori. Molti studi stanno mostrando che gli schemi d'espressione genica si sono rivelati indicatori precisi di sottogruppi di leucemie, di correlazioni con suscettibilità a determinati trattamenti, oppure di prognosi precisa. Naturalmente vi sono interessi finanziari molto rilevanti, perché da una parte questi test sono ancora molto costosi, ed inoltre anche perché molti dei geni utilizzati come 'sonde' sono coperti da brevetto per l'applicazione diagnostica. Quindi c'é da attendersi una battaglia abbastanza feroce a livello di protezione intellettuale.
Diapositiva 36: Impact on vaccination/prevention
La vaccinazione basata sulle conoscenze molecolari é una realtà già da alcuni anni (basterebbe pensare al vaccino contro l'epatite di tipo B). Ciononostante, vi sonno sviluppi del concetto di vaccinazione che vanno ben oltre le malattie infettive. Tra le piste maggiormente seguite troviamo la possibilità di vaccinare contro certe forme tumorali e forse anche contro determinate patologie neuro-degenerative (esempio Alzheimer). Le conoscenze di genomica strutturale e genomica funzionale ci dovrebbero permettere di preparare vaccini di tipo diverso. Preparazioni non più generalizzate, bensì individualizzate, poiché basate sulla configurazione genetica e funzionale del paziente.
Diapositiva 37: Impact on drug administration: principles in pharmacogenetics
Anche la somministrazione di farmaci si effettua oggi in maniera piuttosto generalizzata e basata sui valori medi di tossicità ed efficacia. Come mostra la diapositiva le curve di effetto desiderato (in verde) ed effetto indesiderato (in rosso) sono misurate sulla media di una popolazione di pazienti o volontari. in effetti molti individui possono avere curve diverse (vedi linee punteggiate). Per questi pazienti, una dose che é accettabile per la maggioranza della popolazione potrebbe rivelarsi dannosa o addirittura letale. Migliaia di persone muoiono ogni anno e decine di migliaia soffrono di gravi conseguenze solo per aver assunto farmaci in maniera ritenuta 'appropriata'. La farmacogenetica dovrebbe appunto occuparsi di scovare anticipatamente ed in modo economicamente conveniente queste differenze individuali. La genomica strutturale e la genomica funzionale sono alleati preziosissimi in questa ricerca, in quanto sanno generare risultati inequivocabili anche a partire da piccolissime quantità di tessuto. Come anticipato nella diapositiva 35 i costi iniziali di tali screening basati sulla genomica saranno causati principalmente dagli oneri di protezione di brevetto. Comunque queste condizioni di monopolio non dureranno a lungo poiché moltissimi brevetti concernenti sequenze di DNA sono già stati depositati alcuni anni fa e rimane solamente una frazione del periodo di validità. Ci si può immaginare che alcuni di tali brevetti potranno essere sfruttati al massimo per 4-5 anni.
Diapositiva 38: Impact on therapy I: Biopharmaceuticals
L'utilizzo delle conoscenze sui geni per produrre bio-farmaci come insulina, interferoni eccetera, non é nuovo. Ci si attende che la genomica funzionale e la genomica strutturale possano indicarci nuovi geni-candidati per produrre tali sostanze attive. Di grande interesse saranno i geni che sono implicati nelle reazioni che possono controllare il mantenimento del sistema cardio-vascolare e del sistema nervoso.
Diapositiva 39: Impact on therapy II: improvements of gene therapy?
La terapia genica (www.unifr.ch/nfp37/slides/genetherapy2003.ecpm.html) si basa sull'idea di poter reinserire geni nelle cellule di un tessuto (sia in modo provvisorio che stabile) al fine di correggere o curare malattie e traumi. Le conoscenze di genomica non dovrebbero aver grande impatto immediato sulla terapia genica, però potrebbero contribuire a migliorarne alcuni aspetti tecnici e magari anche taluni concetti, come indicato in questa diapositiva.
Diapositiva 40: Functional genomics mid/long term impact
Riassumendo, le conoscenze in genomica funzionale potranno aiutarci a capire meglio le intricatezze dei vari sistemi di risposta intra-cellulare, dei geni principali e secondari implicati in varie malattie, dei geni importanti per la virulenza di micro-organismi patogeni, ed anche dei geni implicati nella risposta a stimoli che provengono dall'esterno come l'assunzione di cibo o di farmaci. Questo dovrebbe aiutarci a concepire un tipo di medicina che soddisfa due tendenze contraddittorie: da una parte maggiormente attenta ai bisogni dell'individuo (quindi molto più specifica), dall'altra che tenga conto della globalità delle risposte possibili all'interno dell'individuo (quindi indirizzata ad una concezione maggiormente 'olistica').
A lungo termine ci si attende di poter dare una spiegazione a fenomeni complessi che per ora sfuggono ad un'analisi aprioristica come: le conseguenze del polimorfismo genetico sulle predisposizioni sia positive che negative, le patologie complesse e di origine ancora sconosciuta come l'Alzheimer o l'artrite reumatoide o la sclerosi multipla. Non é sempre detto che una conoscenza superiore possa anche generare un trattamento medico migliore, ma non dobbiamo negarci tale possibilità.
Diapositiva 41: Genomics: public understanding and public concern
Anche se accettate in termini di potenziale positivo, le conoscenze sulla genomica suscitano molte perplessità e confusioni a livello pubblico. Queste perplessità sono diverse a seconda dei paesi e delle culture.
Da una parte c'é un pudore intrinseco alla nostra cultura occidentale verso tutto ciò che ha a che fare con la riproduzione ed il sesso. Sotto questa luce, la genomica (che si occupa appunto di analizzare materiale ereditario) diventa automaticamente una disciplina 'sospetta'.
Inoltre c'é tutta una confusione tra discipline di riproduzione umana (come le tecniche di clonazione, la fecondazione in vitro eccetera) e la genetica molecolare. La spettacolarità di tali tecniche, aggiunta alla delicatezza dei problemi psicologici. sociali e legali, assieme alla spregiudicatezza di alcuni personaggi che non esito a definire 'oscuri', sono ingredienti che contribuiscono ad intorbidire il discorso attorno alle vere tecniche di genetica molecolare.
Inoltre vi sono effettivamente alcuni punti specifici sollevati dalla messa in pratica di tecniche legate alla genomica. Dal momento in cui i test di predisposizione daranno risultati effettivamente affidabili, ci si dovrà necessariamente preoccupare della gestione della confidenzialità di tali dati (vedi diapositiva 25). Anzi, probabilmente é un vero vantaggio che queste tecniche siano così animatamente discusse prima di essere messe in pratica. Magari riusciremo a preparare le leggi necessarie prima che sia troppo tardi. Se guardiamo al passato, dobbiamo renderci conto che molte rivoluzioni tecnologiche sono arrivate senza adeguata preparazione culturale e legislatoria, e questo con conseguenze cha vanno dal drammatico al grottesco (Internet, Prozac, Telefonia mobile, Viagra). Quindi vedo qualcosa di buono in questo scetticismo pubblico: cioè la possibilità di preparare con un dialogo costruttivo il terreno migliore per la concretizzazione di queste tecnologie.
Diapositiva 42: Genes, cells, transplants ...
Vi sono anche alcuni scenari catastrofici o apocalittici che sono preconizzati da alcune cerchie intellettuali. In effetti una cattiva gestione delle tecniche di medicina avanzata potrebbe portarci ad un uso che si discosta dai principi fondamentali. Ci si può immaginare che una parte di queste tecniche diventi solo il pretesto per pratiche di cosmetica e miglioramento invece che di vera e propria terapia. Altri vedono solamente un modo come un altro per generare una medicina a due velocità, dove la punta é accessibile a pochi eletti e trasforma gli individui in macchine sofisticate. Infine vi sono scenari secondo i quali sarebbe inevitabile che tali conoscenze siano utilizzate a scopo militare. In effetti il potenziale negativo non manca (pensiamo alla farmacogenetica che potrebbe fornire informazioni su suscettibilità legate alla provenienza etnica). Bisogna consolarsi con la conclusione che il potenziale negativo in una tecnologia é sempre proporzionale al potenziale positivo. Secondo questo principio non é possibile scoprire una tecnologia che abbia esclusivamente potenziale positivo. Non ho esempi che contraddicano tale affermazione che ritengo valida sin dal momento in cui i primi esseri 'umani' hanno imparato la gestione del fuoco fino all'era nucleare.
Diapositiva 43: Genomics conclusion
Le tecniche di genomica sono una passo logico nel progresso della tecnologia genetica. Al giorno d'oggi disponiamo di una buona conoscenza sulle tecniche fondamentali, sulle molecole implicate, e su moltissime sequenze. L'era post-genomica ha già avuto inizio.
Ciononostante ci mancano ancora moltissime conoscenze su quanti geni siano effettivamente operativi nel genoma umano, su quante funzioni possa avere un gene ed il suo (i suoi) prodotto (prodotti). La genomica deve ancora fornire una grande quantità di risposte e questo processo deve essere accompagnato da un discorso pubblico sulle implicazioni sociali e legali che derivano dall'applicazione queste pratiche nella clinica.
I processo di conoscenza innescato con la genetica molecolare sembra comunque inarrestabile ed in crescita esponenziale. Molte applicazioni delle biologia molecolare hanno già raggiunto lo stadio clinico (diagnostico e terapeutico) e vengono adottate con grande successo ed in modo sempre più esteso. Dalla genomica ci si attendono nuove applicazioni a livello diagnostico fra pochi anni, mentre per ottenere nuove terapie basate su queste conoscenze bisognerà attendere ancora più di un decennio.
Con questa diapositiva intendo ringraziare il Centro di Eccellenza sulle malattie Neuro Degenerative (CEND) e l'organizzatore di questo simposio, il Dr. Diego Fornasari. Invito coloro che desiderassero ulteriori informazioni di contattarmi all'indirizzo: sandro.rusconi@unifr.ch
 |
|
