NFP37 SOMATIC GENE THERAPY Divulgation Abstracts phase B

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HOSSLE, Johann	Kinderspital Zuerich, Abteilung Immunologie/Hämatologie, Steinwiesstr. 75, CH-8032 Zuerich tel 01 266 7341; fax 01 266 7171 e-mail: hosslejp@kispi.unizh.ch
Title:	Development of clinically applicable protocols for transitory and permanent somatic gene therapy in chronic granulomatous disease
Co-applicants:
Collaborators:	names
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DIVULGATION TEXT AT SUBMISSION (1998):

text (font Courier, corps 3)

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Bei den septischen Granulomatosen (engl. Chronic Granulomatous diseases, CGD) handelt es sich um eine Gruppe von seltenen angeborenen Immunschwächen, bei denen die Phagozyten im Blut eine charakteristische Unfähigkeit zeigen, in den Körper eingedrungene Bakterien und Pilze abzutöten. Die Phagozyten verfügen normalerweise über ein Enzym, die NADPH- oder Phagozytenoxidase (phox), welche bei Erreger-Kontakt der Zelle Sauerstoff in für die phagozytierten Mikroben toxische Radikale umwandelt. Bei CGD-Patienten ist die Funktion dieser Phagozytenoxidase infolge eines genetischen Fehlers gestört. Die Folgen für die betroffenen Patienten sind immer wiederkehrende und oft lebensbedrohende Bakterien- und Pilzinfektionen von den ersten Lebensmonaten an. Ihre Lebensqualität ist durch die Krankheit stark eingeschränkt. Eine Heilung ist nur durch Knochenmark-transplantation (KMT) möglich, wobei ein passender Knochenmarkspender vorhanden sein muss, was leider nur bei wenigen Patienten der Fall ist. Zwei Drittel der betroffenen Patienten sind Knaben mit einem Defekt in einem Gen auf dem langen Arm des X-Chromosoms (Xp21.1). Dieses Gen kodiert für eine Untereinheit der NADPH-Oxidase, gp91^phox, ein Protein, das für den Elektronentransport im Enzym notwendig ist.

Dieses Projekt war Teil von Forschungsanstrengungen, die darauf abzielen, mittels somatischer Gentherapie bei Patienten rnit dieser X-chromosomal vererbten Form von CGD (X-CGD) den Gendefekt durch die Zugabe einer gesunden Genkopie in den Phagozyten zu kompensieren. Angesichts der Schwere der Krankheit, die man gegenwärtig nicht effizient genug behandeln kann, ist CGD unter den ersten Kandidaten für eine Gentherapie am Menschen und hat damit auch allgemeinen Modellcharakter. Unser gentherapeutische Ansatz der Wahl ist primär die Stammzelltherapie. Dabei soll mit Hilfe von geeigneten viralen Vektoren versucht werden, die benötigte intakte Genkopie bereits am Anfang der Hämatopoese in die pluripotenten Stammzellen oder zumindest in frühe Vorläuferzellen einzubringen. Von einer erfolgreichen Korrektur des Gendefektes würden dabei alle aus den frühen Zellen hervorgehenden Tochterzellen, also auch die ausdifferenzierten Phagozyten profitieren.

Auf der Basis des Murinen Stammzell-Virus (MSCV) wurden zu diesem Zweck retrovirale Vektoren hergestellt, die in der Lage sind, eine gesunde Kopie des X-CGD Genes in CD34⁺ Blut-Vorläuferzellen von Patienten hineinzutragen. Zusätzlich zum therapeutischen gp91^phox Gen wurde in die Retroviren ein menschliches Markergen eingebaut, das erlaubt, festzustellen, welche Zellen infiziert worden sind. Der gleiche Marker kann auch zur selektiven Anreicherung von infizierten Zellen benützt werden. Unsere experimentellen Vorarbeiten im Labor mit Knochenmarkzellen oder mit CD34⁺ Stammzellen aus dem peripheren Blut von X-CGD Patienten, zeigten, dass ein solcher Gentransfer mit grosser Effizienz von über 75% infizierten Zielzellen gelingt. Funktionelle Messungen an behandelten CD34+-Zellen nach Differenzierung in Richtung Phagozyten bewiesen, dass das eingeschleuste gp91^phox -Gen funktioniert. Der CGD-Phenotyp der behandelten Zellen kann korrigiert werden, und die beobachtete Produktion von Sauerstoffradikalen erreichte etwa 50% der normalen Menge. Der bestfunktionierende retrovirale Vektor wurde zusätzlich an Mäusen getestet, die ebenfalls X-CGD haben, und uns als Modell für diese Krankheit beim Menschen dienen. Dabei wurden kranke X-CGD-Mäuse mit Knochenmark transplantiert, das zwar ebenfalls von X-CGD Spendermäusen stammte, aber vor KMT mit unserem Gentherapie-Vektor behandelt worden war. Bei einzelnen der Empfängermäuse konnten über einen Beobachtungszeitraum von 14 Monaten nach KMT bis zu 77% genkorrigierte Zellen im Blut nachgewiesen werden. Dabei zeigte sich, dass eine Anreicherung der infizierten Zellen mit Hilfe des eingebauten Markergens vor der Transplanatation eine deutliche Verbesserung der Resultate bringt. Zusätzlich wollten wir wissen, ob wirklich langlebige Stamm- oder Vorläuferzellen mit unserem Vektor infiziert worden waren. Um dies zu prüfen, wurde Mäusen, die mit genkorrigierten Knochenmarkzellen transplantiert worden waren, einige Monate später Knochenmark entnommen und für eine neue Transplantation in X-CGD-Mäuse verwendet. Im Blut von einigen dieser zweit-transplantierten Mäusen waren nach nahezu 2 Jahren seit der ursprünglichen Behandlung rnit unserem Vektor wiederum und noch korrigierte Granulozyten messbar. Dies spricht deutlich dafür, dass mit unserem retroviralen Vektor bereits sehr frühe blutbildende Vorläufer- oder Stammzellen infiziert wurden. Allerdings scheint auch in einigen der transplantierten Mäuse die Expression der eingeschleusten Gene verstummt zu sein. Die Faktoren die dazu führen werden noch genauer untersucht.

Zusätzlich zu den Versuchen in X-CGD-Mäusen wurden auch Versuche in Mäusen gemacht, in denen menschliche KM-Stammzellen anwachsen können. Dabei zeigte sich, dass menschliche CD34+ -Zellen, die mit dem retroviralen Vektor infiziert wurden, in diesen Mäusen gleich wie unbehandelte menschliche Zellen auwachsen und verschiedene Arten von Blutzellen bilden können.

Zusammenfassend kann geschossen werden, dass der entwickelte Vektor auch in einer klinischen Studie am Menschen funktionieren könnte. Dieser Vektor wird denn nun auch von einer spezialisierten Firma für den möglichen klinischen Gebrauch produziert. Ein erstes erfolgversprechendes Gentherapieprotokoll (Phase I-Studie) mit diesem Vektor wurde von einer kollaborierenden Gruppe in Frankfurt a.M. angemeldet und ist von den zuständigen Komrnissionen in Deutschland bewilligt worden. Weitere Phase I- Studien mit dem gleichen Vektor sind in London und in Zürich in Vorbereitung.

Ueber diese ersten vielversprechenden Schritte hinaus prüfen wir gegenwärtig für die Stammzell-Gentherapie eventuell noch effektivere neue Vektoren aus der Familie der Lentiviren. Zusätzlich arbeiten wir an einer Methode, die den genkorrigierten Zellen einen Selektionsvorteil verschaffen würde und es ihnen ermöglichen sollte, sich neben den noch in grosser Zahl im Knochenmark vorhandenen defekten Zellen erfolgreich einzunisten und durchzusetzen.

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