NFP37 SOMATIC GENE THERAPY Texts for Laypersons

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PD Dr. Thierry Rochat;	Pneumologie; Dép. de Médecine; Hôpital cantonal universitaire; 1211 Genève 14; CH; Tel 022 372 95 46; Fax 022 372 99 29; e-mail: rochat-thierry@diogenes.hcuge.ch
Title:	Somatic gene therapy for cystic fibrosis.
Co-applicants:	Dr. M. Morris (Genève); Prof. S. Suter (Genève); Dr.Marc Chanson
Collaborators:	Dr.Joelle Coclet-Ninin
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ABSTRACT FOR LAYPERSONS 1997:

THERAPIE GENIQUE SOMATIOUE DE LA MUCOVISCIDOSE

La mucoviscidose (en anglais: cystic fibrosis ou CF) est une maladie due à la mutation du gène CFTR, situé sur le chromosome 7. Ce gène contrôle la production d'une protéine du même nom qui joue un rôle clef dans le transport épithélial des électrolytes. La mutation de ce gène se manifeste essentiellement au niveau de l'épithélium qui tapisse les voies respiratoires. Il en résulte les sécrétions anormalement visqueuses et des infections répétées.

Le but de la thérapie génique dans la mucoviscidose est d'introduire la séquence codante d'ADN du gène normal (le CFTR cDNA) dans les cellules épithéliales respiratoires et de le faire s'y exprimer, c'est-à-dire d' entrâmer la production d' ARN messager (mRNA), de proteine CFTR, ainsi qu'une normalisation du transport des électrolytes.

Pour des essais cliniques préliminaires, la muqueuse nasale peut être utilisée comme un site représentatif de la muqueuse respiratoire en général. Elle a l'avantage d'être facilement accessible et de poser moins de problèmes de sécurité que la muqueuse bronchique.

Nous avons administré un adénovirus recombinant porteur du CFTR cDNA humain chez 4 patients atteints de mucoviscidose, en 1'appliquant sur la muqueuse nasale d'un côté et en utilisant l'autre côté comme contrôle selon un protocole à double insu. Nous n'avons pas observé d'effet indésirable résultant de cette application. Du point de vue de l'effi&cacité, nous avons détecté la présence du CFTR cDNA dans les cellules épithéliales du côté traité jusqu'à 12 jours après inoculation. Nous n'avons pu détecter du mRNA que chez un des 4 patients et à une seule occasion (jour 2 après inoculation). Ce même patient a montré entre les jours 1 et 5 une amélioration du transport épithélial du chlore à travers la muqueuse nasale, ce qui indique un effet fonctionnel favorable, mais transitoire.

Nous avons donc pu conclure que le principe de la thérapie génique de patients atteints de mucoviscidose est réalisable, au moins au niveau de la muqueuse nasale. Toutefois, la quantité d'ADN transféré dans les cellules reste très faible. Son expression est inconstante et, quand elle a lieu, de courte durée. Ces résultats sont semblables à ceux que quelques autres centres ont obtenus avec des adénovirus recombinants ou des vecteurs non viraux tels que les liposomes. Il faudra donc à l'avenir développer des vecteurs de gène plus performants que ceux dont nous disposons actuellement.

La deuxième partie de notre projet consiste à mettre au point une méthode de marquage fluorescent des cellules épithéliales prélevées par brossage des voies respiratoires. S'il est possible, en effet, d'estimer le transport du chlore à travers l'épithélium en appliquant une électrode de contact sur la muqueuse nasale, I'application d'une telle électrode dans les bronches est beaucoup plus problématique. En revanche, un échantillonnage de cellules épithéliales bronchiques peut être facilement obtenu lors d'un examen endoscopique. Pour évaluer l'efficacité d'une thérapie génique de la mucoviscidose au niveau des bronches, il serait extrèmement précieux de disposer d'un test applicable sur ces échantillons de cellules qui nous indique si leur transport électrolytique est anormal ou s'il s'est corrigé.

Nous avons étudié dans ce but le marqueur fluorecsent DiSBAC2(3), dont la fluorescence varie en fonction du potentiel de membrane cellulaire. Un clone de cellules épithéliales provenant d'un patient atteint de mucoviscidose (les cellules CFPAC-1) a été comparé à un clone de même origine, mais dans lequel le gène CFTR normal a été introduit de manière durable (cellules PLJCFTR). Ces cellules ont été étudiées par la technique du patch-clamp qui permet de mesurer précisément le potentiel de membrane, ainsi que la conductance de la membrane pour le chlore. Lorsque les cellules PLJ-CFTR sont stimulées par l'AMP cyclique (cAMP), un messager cellulaire qui provoque l'ouverture des canaux perméables au chlore dans la membrane épithéliale, on observe une dépolarisation de la membrane qui témoigne d'une fonction normale, comme on peut l'attendre de cellules de mucoviscidose qui ont été corrigées par la thérapie génique. En revanche, les cellules CFPAC-1 restent incapables d'une telle réponse.

Nous avons alors mesuré la fluorescence émise par ces cellules avec marquage préalable par le DiSBAC2(3), en imposant simultanément des potentiels de membrane d' amplitudes diverses. Les résultats indiquent que l'intensité de la fluorescence est bien corrélée avec le potentiel de membrane dans ces cellules. En particulier, le signal fluorescent indique dans tous les cas le sens exact du changement de potentiel. La précision de la mesure est relativement faible, mais ce point est moins important pour notre utilisation car nous souhaitons essentiellement savoir si les cellules répondent ou non aux stimulations de manière normale ou pathologique.

La prochaine étape de nos travaux consistera à reproduire ces résultats sur des cellules fraichement obtenues de la muqueuse respiratoire (nasale ou bronchique) de sujets normaux ou de patients atteints de mucoviscidose. Si la validité de ce test se confirme, nous diposerons d'une mesure de la fonctionnalité, normale ou pathologique, de l'épithélium respiratoire qui permettra de mieux évaluer l'efficacité de la thérapie génique de la mucoviscidose au cours des essais à venir.

Représentation de l'enregistrement simultané du potentiel de membrane d'une cellule CFPAC-1 et de la fluorescence émise par cette même cellule marquée au DiSBAC2(3). Le tracé supérieur a été enregistré par la technique du patch-clamp. Deux changement de potentiel de membrane, à 20 et 30 mV, ont été imposés à la cellule pendant quelques centaines de secondes chaque fois. Le tracé inférieur montre l'enregistrement de la fluorescence captée par un photomètre connecté au microscope. On voit que le signal fluorescent est proportionnel à la dépolarisation induite, qu'il se stabilise après moins de 10 minutes, et qu'il est totalement réversible.

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