NFP37 SOMATIC GENE THERAPY Texts for Laypersons

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Dr. Johann Hossle;	Universitäts-Kinderklinik; Immunologie / Hämatologie; Steinwiesstr.75; 8032 Zürich; CH; Tel 01 266 73 41; Fax 01 266 71 71; e-mail: hosslejp@kispi.unizh.ch
Title:	Development of clinically applicable protocols for transitory and permanent somatic gene therapy in chronic granulomatous disease.
Co-applicants:	Prof. R. Seger (Zürich); Prof. S. Rusconi (Fribourg)
Collaborators:
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ABSTRACT FOR LAYPERSONS 1997:

Bei den septischen Granulomatosen (engl. Chronic Granulomatous diseases, CGD) handelt es sich um eine Gruppe von seltenen angeborenen Immunschwächen, bei denen die Phagozyten im Blut eine charakteristische Unfähigkeit zeigen, in den Körper eingedrungene Bakterien und Pilze abzutöten. Die Phagozyten verfügen normalerweise über ein Enzym, die NADPH- oder Phagozytenoxidase (phox), welche bei Erreger-Kontakt der Zelle Sauerstoff in für die phagozytierten Mikroben toxische Radikale umwandelt. Bei CGD-Patienten ist die Funktion dieser Phagozytenoxidase infolge eines genetischen Fehlers gestört. Die Folgen für die betroffenen Patienten sind immer wiederkehrende und oft lebensbedrohende Bakterien- und Pilzinfektionen von den ersten Lebensmonaten an. Ihre Lebensqualität ist durch die Krankheit stark eingeschränkt. Eine Heilung ist nur durch Knochenmarktransplantation (KMT) möglich, wobei ein passender Knochenmarkspender vorhanden sein muss, was leider nur bei wenigen Patienten der Fall ist. Zwei Drittel der betroffenen Patienten sind Knaben mit einem Defekt in einem Gen auf dem langen Arm des X-Chromosoms (Xp21.1). Dieses Gen kodiert für eine Untereinheit der NADPH-Oxidase, gp91-phox, ein Protein, das für den Elektronentransport im Enzym notwendig ist.

Unser Projekt hat zum Ziel, mittels somatischer Gentherapie bei Patienten mit dieser Xchromosomal vererbten Form von CGD (X-CGD) den Gendefekt durch die Zugabe einer gesunden Genkopie in den Phagozyten zu kompensieren. Angesichts der Schwere der Krankheit, die man gegenwärtig nicht effizient genug behandeln kann, ist CGD eine der ersten Kandidatinnen für die Gentherapie am Menschen. Sie bekommt hiermit auch allgemeinen Modellcharakter. Unser gentherapeutische Ansatz der Wahl ist die Stammzelltherapie. Dabei soll mit Hilfe von Retroviren versucht werden, die benötigte intakte Genkopie bereits am Anfang der Hämatopoese in die pluripotenten Stammzellen einzubringen. Von einer erfolgreichen Korrektur des Gendefektes profitieren dabei alle aus den Stammzellen hervorgehenden Tochterzellen, also auch die ausdifferenzierten Phagozyten.

Auf der Basis des Murinen Stammzell-Virus (MSCV) wurden zu diesem Zweck retrovirale Vektoren hergestellt, die in der Lage sind, eine gesunde Kopie des X-CGD Genes in CD34+ BlutVorläuferzellen von Patienten hineinzutragen. Zusätzlich zum therapeutischen gp91-phox Gen wurde in die Retroviren ein menschliches Markergen eingebaut, das erlaubt, festzustellen, welche Zellen infiziert worden sind. Der gleiche Marker kann auch zur selektiven Anreicherung von infizierten Zellen benützt werden. Unsere bisherigen experimentellen Vorarbeiten im Labor rnit Knochenmarkzellen von X-CGD Patienten, zeigen, dass ein solcher Gentransfer mit grosser Effizienz von über 75% infizierten Zielzellen gelingt. Funktionelle Messungen an behandelten CD34+-Zellen nach Differenzierung in Richtung Phagozyten beweisen, dass das eingeschleuste gp91-phox Gen funktioniert. Der CGD-Phenotyp dieser Zellen ist korrigiert, und ihre Produktion von Sauerstoffradikalen erreicht etwa 50% der normalen Menge.

Diese Erfolge sind ermutigende erste Schritte auf dem Weg hin zur Realisierung der Gentherapie für X-CGD in der Klinik. Drei mögliche klinische Szenarien stehen dabei im Vordergrund (Figur1):

A: Repetitive Gabe gentransduzierter CD34-Zellen z.B. alle 2 Monate an nichtinfizierte CGDPatienten ohne Chemotherapie.

B: Infusion gentransduzierter patienten-eigener CD34 Zellen 1-2 Tage nach KMT im Sinne einer Genmarkerstudie bei Patienten, bei denen eine allogene KMT durchgeführt wird.

C: CD34-Transduktion mit anschliessender Ausreifung zu phagozytierenden Zellen in der Beutelkultur im Labor bei Patienten mit chronischen, antibiotikasupprimierten Infektionen.

Damit eine permanente Heilung von X-CGD Patienten mittels retroviraler Gentherapie möglich wird, sind noch zwei grosse Herausforderungen zu meistern. 1. Es muss ein Vorgehen gefunden werden, das den genkorrigierten Zellen ermöglicht, sich neben den, wenn keine Chemotherapie durchgeführt wird, noch in grosser Zahl im Knochenmark vorhandenen defekten Zellen erfolgreich einzunisten. 2. Die Retroviren müssen so konstruiert sein, dass das eingeschleuste therapeutische Gen im Langzeitverlauf sicher und gewebespezifisch funktioniert. An möglichen Lösungen wird noch weiter gearbeitet werden müssen.

Bei den septischen Granulomatosen (engl. Chronic Granulomatous diseases, CGD) handelt es sich um eine Gruppe von seltenen angeborenen Immunschwächen, bei denen die Phagozyten im Blut eine charakteristische Unfähigkeit zeigen, in den Körper eingedrungene Bakterien und Pilze abzutöten. Die Phagozyten verfügen normalerweise über ein Enzym, die NADPH oder Phagozytenoxidase (phox), welche bei Erreger Kontakt der Zelle Sauerstoff in für die phagozytierten Mikroben toxische Radikale umwandelt. Bei CGDPatienten ist die Funktion dieser Phagozytenoxidase infolge eines genetischen Fehlers gestört. Die Folgen für die betroffenen Patienten sind immer wiederkehrende und oft lebensbedrohende Bakterien und Pilzinfektionen von den ersten Lebensmonaten an. Ihre Lebensqualität ist durch die Krankheit stark eingeschränkt. Eine Heilung ist nur durch Knochenmarktransplantation (KMT) möglich, wobei ein passender Knochenmarkspender vorhanden sein muss, was leider nur bei wenigen Patienten der Fall ist. Zwei Drittel der betroffenen Patienten sind Knaben mit einem Defekt in einem Gen auf dem langen Arm des X-Chromosoms (Xp21.1). Dieses Gen kodiert für eine Untereinheit der NADPH-Oxidase, gp91phox, ein Protein, das für den Elektronentransport im Enzym notwendig ist.Unser Projekt hat zum Ziel, mittels somatischer Gentherapie bei Patienten mit dieser X-chromosomal vererbten Form von CGD (XCGD) den Gendefekt durch die Zugabe einer gesunden Genkopie in den Phagozyten zu kompensieren. Angesichts der Schwere der Krankheit, die man gegenwärtig nicht effizient genug behandeln kann, ist CGD unter den ersten Kandidaten für eine Gentherapie am Menschen und hat damit auch allgemeinen Modellcharakter. Unser gentherapeutische Ansatz der Wahl ist primär die Stammzelltherapie. Dabei soll mit Hilfe von Retroviren versucht werden, die benötigte intakte Genkopie bereits am Anfang der Hämatopoese in die pluripotenten Stammzellen oder zumindest in frühe Vorläuferzellen einzubringen. Von einer erfolgreichen Korrektur des Gendefektes profitieren dabei alle aus den frühen Zellen hervorgehenden Tochterzellen, also auch die ausdifferenzierten Phagozyten.Auf der Basis des Murinen Stammzell-Virus (MSCV) wurden zu diesem Zweck retrovirale Vektoren hergestellt, die in der Lage sind, eine gesunde Kopie des X-CGD Genes in CD34+ Blut-Vorläuferzellen von Patienten hineinzutragen. Zusätzlich zum therapeutischen gp91phox Gen wurde in die Retroviren ein menschliches Markergen eingebaut, das erlaubt, festzustellen, welche Zellen infiziert worden sind. Der gleiche Marker kann auch zur selektiven Anreicherung von infizierten Zellen benützt werden. Unsere bisherigen experimentellen Vorarbeiten im Labor mit Knochenmarkzellen von X-CGD Patienten, zeigen, dass ein solcher Gentransfer mit grosser Effizienz von über 75% infizierten Zielzellen gelingt. Funktionelle Messungen an behandelten CD34+-Zellen nach Differenzierung in Richtung Phagozyten beweisen, dass das eingeschleuste gp91phox-Gen funktioniert. Der CGD-Phenotyp dieser Zellen ist korrigiert, und ihre Produktion von Sauerstoffradikalen erreicht etwa 50% der normalen Menge. Der best- funktionierende retrovirale Vektor wurde zusätzlich an Mäusen getestet, die ebenfalls X-CGD haben, und uns als Modell für diese Krankheit beim Menschen dienen. Dabei wurden kranke X-CGD-Mäuse mit Knochenmark transplantiert, das zwar ebenfalls von X-CGD Spendermäusen stammte, aber vor KMT mit unserem Gentherapie-Vektor behandelt worden war. Bei einigen der Empfängermäuse konnten während mindestens 7 Monaten nach KMT bis zu 35% genkorrigierte Zellen im Blut nachgewiesen werden. Diese Tests zeigten, dass unser Vektor funktioniert. Mögliche Gentherapieprotokolle beim Menschen müssen aber im Detail noch ausgearbeitet werden, weil Protokolle, wie sie bei der Maus verwendet wurden, beim Menschen so nicht angewandt werden könnten. Dennoch sind diese Erfolge ermutigende Schritte auf dem Weg hin zur Realisierung der Gentherapie für X-CGD in der Klinik. Drei mögliche klinische Szenarien stehen dabei im Vordergrund:
A) Repetitive Gabe gentransduzierter CD34+ -Zellen z.B. alle paar Monate an nichtinfizierte CGDPatienten ohne Chemotherapie.
B) Infusion gentransduzierter patienten-eigener CD34+ -Zellen in Kombination mit einer sehr milden Chemotherapie, die helfen soll, den verabreichten Zellen Platz zu schaffen.
C) CD34+ -Transduktion mit anschliessender Ausreifung zu phagozytierenden Zellen in der Beutelkultur im Labor bei Patienten mit chronischen, antibiotikasupprimierten Infektionen.
Damit eine permanente Heilung von X-CGD Patienten mittels retroviraler Gentherapie möglich wird, sind noch zwei grosse Herausforderungen zu meistern. 1. Es muss ein Vorgehen gefunden werden, das den genkorrigierten Zellen ermöglicht, sich neben den noch in grosser Zahl im Knochenmark vorhandenen defekten Zellen erfolgreich einzunisten. 2. Die Retroviren müssen so konstruiert sein, dass das eingeschleuste therapeutische Gen im Langzeitverlauf sicher und gewebespezifisch funktioniert. An möglichen Lösungen wird noch weiter gearbeitet werden müssen.

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